Le Méthotrexate est un antifolique, ce qui implique qu'il agit lors d'une phase spécifique du cycle de la réplication.
Il a comme effet d'inhiber la dihydrofolate reductase, enzyme impliquée dans la Synthèse de l'acide folique. Son effet peut donc être supprimé en donnant du folinate de calcium (tétrahydrofolate, ou acide folique).
Le Méthotrexate est éliminé par sécrétion tubulaire.